導讀

? iTRAQ/TMT定量蛋白組學(xué)技術(shù)

? iTRAQ/TMT標簽分子組成

? iTRAQ/TMT技術(shù)原理

iTRAQ和TMT標簽介紹

說(shuō)到iTRAQ和TMT很多人可能會(huì )以為這是兩中不同的定量組學(xué)技術(shù)，但其實(shí)呢，iTRAQ和TMT技術(shù)只是生產(chǎn)商不同，除了標記規格和標簽分子結構有些許差異，標記肽段的原理基本上是一樣的。其中iTRAQ由AB SCIEX所開(kāi)發(fā)，緊接著(zhù)Thermo Fisher研發(fā)了TMT，二者只是專(zhuān)利不同，使用原理基本一致。

iTRA Tag for Relative anduantitation

TMT：Tandem Mass Tag

iTRAQ-TMT標簽結構以及相對定量原理詳解－百泰派克生物

iTRAQ和TMT標記實(shí)質(zhì)上就是一種化學(xué)體外標記試劑，能夠特異性標記蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)生的多肽。iTRAQ和TMT標記的蛋白樣品規格不同，TMT能夠標記更廣泛的樣品數，能夠定量分析多組蛋白樣品，少至2個(gè)蛋白樣品，多至10個(gè)蛋白樣品，TMT蛋白定量都能夠做到。通過(guò)標記多組不同樣品，TMT和iTRAQ能夠比對正常組織樣品和腫瘤組織樣品的蛋白水平差異，以及精準檢測腫瘤在發(fā)展的不同階段的蛋白水平變化。

iTRAQ和TMT的標記原理一樣，兩種標簽的結構卻有一些差異，我們來(lái)看看ITRAQ和TMT的標簽結構一個(gè)各自的細微差異吧

iTRAQ與TMT的分子結構比較

iTRAQ與TMT的分子結構比較

從上圖來(lái)說(shuō)，我們可以看到iTRAQ和TMT標簽在結構上有著(zhù)明顯的差異，也有著(zhù)一些共同點(diǎn)，兩個(gè)標簽都由報告基團，平衡基團以及肽反應基團組成，兩個(gè)標簽的各自報告基團和平衡基團的總重都是一定的。兩個(gè)標簽的肽反應基結構也是一樣的。iTRAQ和TMT標簽的差異在于平衡基團的結構，從下圖可以看到TMT的平衡基團結構比iTRAQ標簽的更為復雜。iTRAQ標簽的平衡基團只有幾十Da，而TMT的平衡基團接近200Da，這也是造成iTRAQ和TMT標簽質(zhì)量差異的原因。

簡(jiǎn)單介紹完兩個(gè)標簽的結構后，我們再以iTRA標簽為例，詳細認識一下iTRAQ分子標簽的結構組成

iTRAQ分子結構組成

iTRA標簽結構

iTRAQ標簽分子骨架由三部分核心組件構成：報告基團，平衡基團和肽反應基團。其中，報告基團和平衡基團構成等基團。不同的iTRAQ標簽的報告基團的重量不同，4-plex標簽的報告基團重量分別是：114，115，116，117Da；平衡基團的質(zhì)量分別是：31，30，29，28Da，使得4個(gè)iTRAQ標簽的報告基團總重都是145Da。一個(gè)核心組件就是肽反應基團，其主要的功能就是與多肽游離的N端氨基發(fā)生置換反應，使同位素標簽共價(jià)交連到肽段N端。

前面說(shuō)到標簽報告基團和平衡基團的質(zhì)量，很多人可能會(huì )好奇，標簽的報告基團僅僅相差幾個(gè)Da，這是如何做到的呢？其實(shí)這就是利用了同位素標記的原理。下面我們以iTRAQ標簽為例進(jìn)行解釋。

如下圖，質(zhì)量為114的報告基團包含1個(gè)C13，報告基團質(zhì)量增加1Da。平衡基團包含1個(gè)C13和1個(gè)O18，質(zhì)量總共增加3Da，114標簽的總質(zhì)量增加4Da。以此類(lèi)推，115的報告基團增加2Da，平衡基團增加2Da；116的報告基團增加3Da，平衡基團增加1Da；117的報告基團增加4Da，平衡基團增加0Da。以上四個(gè)標簽通過(guò)對報告基團和平衡基團進(jìn)行不同的同位素標記后，各自的報告基團和平衡基團的增加質(zhì)量不同，增加的總的質(zhì)量是一樣的，標簽的總重相等。

iTRAQ標簽的同位素標記

標簽與肽段反應的過(guò)程

肽段標記反應過(guò)程

iTRAQ相對定量研究原理

蛋白質(zhì)被裂解為肽段，用iTRAQ試劑進(jìn)行差異標記。由于iTRAQ試劑是等量的，即不同同位素在標記同一多肽后在第一級質(zhì)譜檢測，分子量完全相同，用串聯(lián)質(zhì)譜方法對在第一級質(zhì)譜檢測到前體離子進(jìn)行碰撞誘導解離，產(chǎn)物離子通過(guò)第二級質(zhì)譜進(jìn)行分析。在二級質(zhì)譜分析過(guò)程中，報告基團、質(zhì)量平衡基團和多肽反應基團之間的鍵斷裂，質(zhì)量平衡基團丟失，產(chǎn)生低質(zhì)荷比(m/z)的報告離子。由于二級質(zhì)譜可分析相對分子質(zhì)量相差1的報告基團，不同報告基團離子強度的差異就代表了它所標記的多肽的相對豐度。多肽內的酰胺鍵斷裂，形成一系列 b 離子和 y 離子，得到離子片段的質(zhì)量數，通過(guò)數據庫查詢(xún)和比較，可以鑒定出相應的蛋白質(zhì)前體。

iTRAQ定量分析原理

iTRAQ相對定量研究流程

iTRAQ定量分析流程

1-. 對不同的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行酶切消化成多肽片段

2. 使用不同的iTRAQ標簽對不同蛋白樣品消化產(chǎn)生的多肽片段分別進(jìn)行標記，不同的iTRAQ標簽的總質(zhì)量是一樣的。

3. 比例混合各個(gè)標記后的樣品

4. 帶上標記的多肽片段經(jīng)過(guò)一級質(zhì)譜分離，在一級質(zhì)譜中，iTRAQ標簽由于總質(zhì)量數一樣，來(lái)自不同蛋白樣品的相同肽段不能被區分，會(huì )一起進(jìn)入二級質(zhì)譜分析

5. 在二級質(zhì)譜中，在高能碰撞下iTRAQ的平衡基團會(huì )被打碎，報告基團得到釋放，肽段也被釋放，碰撞碎裂成二級碎片。這時(shí)通過(guò)分析肽段的氨基酸序列，可以推測對應的蛋白質(zhì)的序列；各個(gè)報告基團的在質(zhì)譜中的信號強度代表多肽在4組樣品中的相對豐度，即反應相應的蛋白質(zhì)在4組樣品中的相對表達水平。

百泰派克生物科技-您身邊的生物質(zhì)譜專(zhuān)家
北京百泰派克生物科技有限公司（Beijing Bio-Tech Pack Technology Company Ltd. 簡(jiǎn)稱(chēng)BTP）從事以生物質(zhì)譜為依托的生物藥物表征，大分子物質(zhì)（包括蛋白質(zhì)、多肽、代謝物）質(zhì)譜分析以及小分子物質(zhì)檢測服務(wù)。公司采用ISO9001質(zhì)量控制體系，專(zhuān)業(yè)提供以質(zhì)譜為基礎的CRO檢測分析服務(wù)，業(yè)務(wù)范圍覆蓋蛋白質(zhì)組學(xué)、多肽組學(xué)、代謝組學(xué)、生物藥物表征、單細胞分析、單細胞質(zhì)譜流式、生信云分析以及多組學(xué)生物質(zhì)譜整合分析等。7大質(zhì)量控制檢測平臺，服務(wù)3000+企業(yè)，10000+客戶(hù)的選擇，致力于為您提供y_ō_u|z_h_ì的生物質(zhì)譜分析服務(wù)!